LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA
Una prueba para el seguimiento y control en Diabetes Mellitus

La glucosa es un monosacáridos con fórmula molecular C6H12O6, relativamente rica en energía y su oxidación hasta CO2 y agua provee de los metabolitos (cualquier molécula utilizada o producida durante el metabolismo) necesarios para la producción de ATP (molécula de alto contenido energético). Es el compuesto orgánico más abundante en la naturaleza y es el componente principal de polímeros como la celulosa, el almidón y el glucógeno. La forma química D-glucosa es muy importante para los seres vivos. .

Los organismos autótrofos (plantas) son capaces de sintetizar glucosa por medio de la fotosíntesis, a partir de compuestos inorgánicos; mientras que los seres heterótrofos (animales) toman la glucosa a partir de los alimentos, o bien la producen por una vía metabólica (anabólica) llamada neoglucogénesis (síntesis de glucosa) y se almacena principalmente en el hígado, el cual tiene un papel primordial en el mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre (glucemia).

Para obtener la energía contenida en esta molécula, la glucosa tiene que entrar a la célula, al no poder difundirse directamente hacia el interior de ella, esta utiliza un proceso de transporte mediado por una familia de proteínas de membranas llamadas GLUT (transportador de glucosa); este mecanismo de transporte se denomina Transporte de difusión facilitada independiente del Na+ (de una concentración elevada de glucosa a una más baja). Es así, como las células de algunos tejidos, como por ejemplo el musculo, presentan GLUT cuya expresión en la membrana se realiza a expensas de la concentración de la hormona insulina (llamados tejidos insulino-dependientes), en tanto que en otros tejidos (cerebro) se presentan GLUT que permanecen expresados en las membranas de sus células, permitiendo la entrada de glucosa independiente de la concentración de insulina presente.
También existe otro mecanismo de transporte para la glucosa, el cual es el sistema cotransportador de Na+ y monosacáridos, este es un proceso que requiere energía y transporta glucosa en contra de un gradiente de concentración (de concentraciones bajas fuera de las células a concentraciones mas elevadas en el interior de ellas). Este sistema es un proceso mediado por transportadores en el que el desplazamiento de glucosa está acoplado al gradiente de concentración de Na+, que al mismo tiempo se transporta hacia el interior de la célula.
La insulina es una hormona polipeptídidica producida por las células beta de los islotes de Langerhans, (cúmulos de células incrustados en la porción exocrina del páncreas). La insulinemia (concentración de insulina en la sangre) depende principalmente del estimulo realizado por el aumento fisiológico de la concentración de glucosa en sangre luego de ingerir alimentos. Es la hormona más importante que coordina el uso de combustibles en los tejidos. Sus efectos metabólicos son anabólicos, favorecen la síntesis de glucógeno, triglicéridos y proteínas.
La unión de esta hormona con un receptor de membrana, ocasiona que la subunidades alfas del receptor se acerquen y este cambio conformacional permite que se enlace ATP a los dominios intracelulares de las subunidades beta del receptor. La unión del ATP facilita la autofosforilación del receptor, lo cual estimula su actividad tirosina quinasa y promueve la fosforilación de sustratos proteicos en residuos de tirosina. Estas series de eventos que ocurren al transcurso de esta cascada, permite, por una parte, la entrada de glucosa a algunos tejidos insulino-dependientes y, por otra, esta hormona lleva a la disminución de la concentración en sangre de la glucosa, es decir, tiene actividad hipoglucemiante ya que, activa enzimas claves en la regulación de la glucolisis y síntesis de glucógeno e inhiben enzimas claves en la regulación de la neoglucogenesis y glucogenólisis.
La disminución de la concentración de glucosa en sangre conlleva a la estimulación de las células alfa de los islotes de Langerhans pancreáticos para la secreción de la hormona glucagon. El glucagon es una hormona polipeptídica, hiperglucemiante, que se una a su receptor de membrana, el cual esta acoplado con una proteína G, la cual en su estado inactivo enlaza GDP, pero cuando este nucleótido es intercambiado por una molécula de GTP, la proteína pasa a su estado activo. Como consecuencia de la unión de la hormona y del cambio conformacinal resultante, el receptor interacciona con una proteína Gs cercana. Al unirse Gs al receptor, El GDP se disocia y se sustituye por GTP, separándose la subunidad alfa del complejo BY. La subunidad alfa activada interacciona con la adenilato ciclasa y la estimula. La adenilato ciclasa cataliza entonces la síntesis de AMPc y PPi a partir de Mg+2 ATP, y las moléculas de AMPc formadas difunden al citoplasma, donde se unen a una proteína quinasa dependiente de AMPc (proteína quinasa A) y la activan, esta proteína fosforila residuos de serina y treonina y, de esta forma, altera la actividad catalítica de enzimas reguladoras claves, como las enzimas reguladoras de la glucolisis y síntesis de glucógeno las cuales las inhiben, activando enzimas reguladoras que participan en procesos de formación de glucosa a partir de compuestos no carbohidratos (neoglucogenesis) y glucogenólisis.
Estos dos procesos: la glicolisis y la neoglucogénesis están en contraposición, es decir, que mientras uno esta activo el otro debe estar inhibido y viceversa. Esto permite una concentración de glucosa estable en la sangre y garantiza que el suministro de glucosa para las células sea el adecuado.
El desequilibrio en estos procesos debido a alguna causa, como por ejemplo, disminución de la cantidad de insulina, ausencia, o mutación de su gen lleva a la acumulación de glucosa en la sangre, lo que se traduce en aumento de su concentración por encima de los valores de referencia tomados como normales de glucosa (60-110 mg/dL), en situación de ayuno de 12 horas máximo. Si esta situación es mantenida en el tiempo, da lugar a una serie de complicaciones en diferentes órganos. Por lo tanto, la determinación de la concentración de glucosa en sangre (glucemia) es útil para el diagnostico de numerosas enfermedades metabólicas, fundamentalmente de la diabetes mellitus. La determinación de glucosa en orina (glucosuria) suele formar parte rutinaria de los análisis de orina, donde no aparece en condiciones normales. Sin embargo, cuando los valores de glucosa en sangre superan concentraciones de 180 mg/dL ésta puede ser filtrada por el riñón y eliminada por la orina, apareciendo la glucosuria.
Determinación de glucosa (método glucosa - oxidasa)
Está basado en el esquema indicado a continuación. La glucosa oxidasa oxida a la glucosa originando ácido glucónico y H2O2. El peróxido de hidrógeno liberado reacciona con un cromógeno (fenol/4-aminoantipirina) por la reacción de Trinder, para dar una quinona que absorbe entre 492 y 550 nm. La intensidad de color producida es directamente proporcional a la concentración de glucosa.
Puede analizarse por este método cualquier muestra: suero libre de hemólisis, plasma, líquido cefalorraquídeo, orina, un hidrolizado de muestras de hígado para valorar glucógeno, etc.
1. Paso primero: Pipetear en tubos marcados como: blanco, estándar y muestras, los reactivos indicados (composición en Anexo). Incluir tantos tubos de muestras como se considere conveniente. Añadir en último lugar el reactivo para comenzar la reacción.
Reactivos
Blanco
Estándar
Problema
Estándar
(glucosa, 100 md/dL)
-
20 μL
-
Muestra
-
-
20 μL
Reactivo
2 mL
2 mL
2 mL
2. Paso segundo: Incubar, 15 min a 37 ºC ó 30 min a temperatura ambiente.
3. Paso tercero: Ajustar el espectofotómetro a cero de absorbancia (DO) a la longitud de onda de 500 nm y utilizando el tubo blanco, y leer los tubos restantes.
Con los valores de absorbancia (DO) del estándar y de los tubos problema se puede calcular la concentración de glucosa en la muestra.
Conc. problema = DO problema x concentración estándar
DO estándar
Valores normales:
Suero o plasma: 70 - 110 mg/ dL
L.C.R.: 50 - 70 mg/ dL
Orina: No contiene, en condiciones fisiológicas normales.
La diabetes mellitus es una enfermedad que cursa con niveles aumentados de glucosa en sangre por encima de los normales. Existen dos tipos: La tipo 1, cuya etiología es por déficit de insulina o destrucción de las células β del páncreas en la cual los pacientes son isulino-dependientes y se presenta en niños y jóvenes, y la tipo 2 que se presenta generalmente en personas mayores de 40 años que presentan obesidad; se debe principalmente a la disminución en la producción de insulina o daño (mutaciones) en los receptores para esta hormona, estos pacientes no necesitan inyectarse insulina y pueden ser controlados con dietas bajas en carbohidratos.
En el organismo hay proteínas que de manera natural se unen a carbohidratos, este proceso generalmente es llevado a cabo en el aparato de golgi de las células. Sin embargo, en la diabetes existe una hiperglicemia permanente, lo que puede llevar a la unión de la glucosa con algunas proteínas. En los últimos 50 años se encontró que la hemoglobina puede combinarse de manera no enzimática e irreversible con la glucosa.
La hemoglobina es una hemoproteína que se encuentra exclusivamente en los eritrocitos, en los que su función principal es transportar oxigeno desde los pulmones hacia los capilares en los tejidos.
La hemoglobina de los individuos sanos adultos está compuesta por tres variedades denominadas hemoglobina A del adulto (HbA), hemoglobina A2 (HbA2) y hemoglobina F o fetal (HbF). La hemoglobina A es la más abundante (97 %). A su vez, dentro de la fracción de hemoglobina A, se pueden distinguir varios grupos con distinta movilidad durante el procedimiento de electroforesis. Así se observan variedades de hemoglobina A de movilidad rápida denominadas HbA1a, HbA1b y HbA1c. Existen diversas combinaciones de grupos de aminoácidos y carbohidratos que dan lugar a diversas formas moleculares de hemoglobina glicosilada y así a una amplia nomenclatura. A la determinación de Hemoglobina glicosilada se la puede encontrar en la literatura con otros nombres, como por ejemplo: Índice de control diabético; HbG; Gluco-hemoglobina; A1C.
La HbA1c es la más abundante de las hemoglobinas del tipo A1. Se trata de una molécula de hemoglobina que incorporó glucosa en la porción N-terminal de la cadena beta.
Debido a que el promedio de vida de un eritrocito es de 120 días, se puede analizar (medir, cuantificar) el porcentaje de hemoglobina que se ha glucosilado en este periodo de tiempo; esto puede brindar información sobre el nivel de glucosa en sangre en un período previo de cuatro meses. Esta evaluación tiene una clara ventaja sobre el análisis directo de la concentración de glucosa en sangre, en función de evaluar el seguimiento y control de un paciente diabético, debido a que la medición de hemoglobina glicosilada está libre de las amplias fluctuaciones que se observandurante el análisis de glucosa en sangre, las cuales dependen de diversos factores como el momento del día de la toma de la muestra, el consumo de alimentos y la actividad física realizada antes de realizar el ensayo. La prueba de hemoglobina glicosilada es muy importante, puesto que con ella se evalúa el comportamiento en el tiempo de los valores de glucosa, es decir, la adherencia del paciente con respecto a la terapéutica y su respuesta ante ella. Sin embargo, la medición del porcentaje de hemoglobina glucosilada no puede sustituir al monitoreo de glucemias, ya que ésta no puede medir su control diario y, por lo tanto, no le permite ajustar sus dosis de insulina e ingesta de alimentos en el día a día a aquellos pacientes que así lo necesiten. Estas dos pruebas se complementan, ya que buscan evaluar al paciente desde perspectivas distintas.
Existen varias técnicas que se utilizan para medir esta fracción de la hemoglobina y los diferentes métodos analíticos detectan diversas fracciones:
  • Procedimientos Inmunológicos (inmunoturbidimétricos)

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Electroforesis. (Tomado de http://javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/electroforesis.html)
  • Electroforesis (Isoelectroenfoque). Es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
(Tomado de http://santander237.blogspot.com/2010/04/aplicando-la-biotecnologia-en-biologia.html)
Cromatografía de intercambio iónico,.Es un proceso que permite la separación de iones y moléculas polares basado en las propiedades de carga de las moléculas. (Tomado de http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_de_intercambio_i%C3%B3nico)


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Cromatografía de intercambio iónico.(Tomado dehttp://javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/intercambio.jpg)

Cromatografía de la afinidad. Permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. (Tomado de http://javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.htm)



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Cromatografía de afinidad. Basado en la interacción específica entre dos moléculas (Ag-Ac, Enz-Sustrato, Lectina-HC, Metal-aa). Una de las moléculas, el ligando, se inmoviliza en la resina. (Modificado por Br. Ricardo Bello, de http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_de_afinidad.pdf)

HPLC o LPLC
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Sistema de HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Eficacia). El uso de partículas de menor diámetro (<10 micras) mejora drásticamente el poder de separación. La HPLC emplea bombas y columnas diseñadas para soportar las altas presiones que son necesarias para vencer la mayor resistencia al flujo que ejercen estas partículas. (Modificado por Br. Ricardo Bello, dehttp://www.waters.com/waters/nav.htm?cid=10049055)

La Asociación Americana de Diabetes (ADA) reconoció la importancia de la medición de la hemoglobina glicosilada en el control de la diabetes en el año 1986, cuando recomendó el uso de dos medidas anuales de hemoglobina glicosilada para realizar el seguimiento de la patología. En el año 1993 se presentaron los resultados de un trabajo conocido como Estudio de Control y Complicaciones de la Diabetes (Diabetes Control and Complications Trial o DCCT). En esta investigación se observó por primera vez que la reducción en el valor de la hemoglobina glicosilada estaba asociada con una disminución en el riesgo de desarrollar complicaciones de la diabetes a largo plazo.

Elaborado por: Br. Rashel Aguilera R.
Referencias Bibliográficas y Electrónicas


  • Pamela C. Champe, PhD. Bioquímica. Mc graw Hill.

  • Diaz, K. (2011). Transducción de señales. Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.